Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Методика. Добавляют 5 мл реактива кислотного синего 90 Р к 0,100 мл каждого раствора сравнения, исследуемого и контрольного раствора. Смешивают, избегая образования пены. Определяют оптическую плотность(2.2.25.) стандартных растворов и исследуемого раствора при длине волны 595 нм, используя контрольную пробу в качестве раствора сравнения. Не используют кварцевые (кремниевые) спектрофотометрические кюветы, поскольку краситель связывается с этим материалом.
Расчеты. Зависимость оптической плотности от концентрации белка не является линейной, тем не менее, если диапазон концентраций, используемый для построения стандартного графика небольшой, он близок к линейности. Строят графическую функцию оптической плотности стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения стандартного графика. На основании стандартного графика и оптической плотности определяют концентрацию белка в исследуемом растворе.
МЕТОД 4
Данный метод (известный как метод бицинхонинической кислоты БХК) основывается на восстановлении белком иона двухвалентной меди (Cu2+) в ион одновалентной меди (Cu1+). Реагент бицинхонинической кислоты применяется для определения иона, содержащего одновалентную медь. С реакцией интерферируют несколько веществ. Эффект интерферирующих веществ может быть минимизирован
с помощью разведения, обеспечивающего концентрацию исследуемого белка на уровне, достаточном для проведения точных измерений.
Осаждение белка, описанное в Методе 2, может быть использовано для удаления интерферирующих субстанций. Поскольку различные белки могут давать цветные реакции различной интенсивности, стандартное вещество и исследуемый белок должны быть одинаковыми.
Для приготовления всех буферных растворов и реактивов, применяемых в данном методе, используют воду дистиллированную Р.
Исследуемый раствор. Достаточное количество вещества, предназначенного для исследования, растворяют в указанном в частной статье буферном растворе для получения раствора с концентрацией в пределах интервала стандартного графика.
Стандартные растворы. Стандартное вещество, предназначенное для определения белка, растворяют в буферном растворе, используемым при приготовлении исследуемого раствора. Данный раствор разводят порционно этим же буферным раствором, чтобы получить не менее пяти растворов сравнения с концентрациями белка, равномерно распределенными в интервале между 10 мкг/мл и 1200 мкг/мл.
Контрольный раствор. Используют буферный раствор, применяемый для приготовления тестового раствора и стандартных растворов.
БХК реактив. В воде дистиллированной Р растворяют 10 г динатрия бицинхонината Р, 20 г натрия карбоната моногидрата Р, 1,6 г натрия тартрата Р, 4 г натрия гидроксида Р, и 9,5 г натрия гидрокарбоната Р. При необходимости регулируют pH раствора до 11,25 раствором натрия гидрооксида Р_или раствором натрия гидрокарбоната Р, доводят объем до 1000 мл водой дистиллированной Р и перемешивают.
Медно-бицинхонинатовый реактив. Смешивают 1 мл раствора 40г/л меди сульфата Р и 50 мл БХК реактива.
Методика. Смешивают 0,1 мл каждого стандартного раствора, исследуемого раствора и контрольного раствора с 2 мл медно-бицинхонинатового реактива. Инкубируют раствор при температуре 37оС в течение 30 мин. Засекают время для остывания смеси до комнатной температуры и через 60 мин после окончания инкубирования определяют оптические плотности (2.2.25) стандартных растворов и исследуемого раствора в кварцевых кюветах при длине волны 562 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения. Необходимо учитывать, что после остывания растворов до комнатной температуры, интенсивность цвета постепенно возрастает.
Расчеты. Зависимость оптической плотности от концентрации белка не является линейной, тем не менее, если диапазон концентраций, используемый для построения стандартного графика небольшой, он близок к линейности. Строят графическую функцию оптической плотности стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения стандартного графика. На основании стандартного графика и оптической плотности определяют концентрацию белка в исследуемом растворе.
МЕТОД 5
Данный метод (известный как биуретовый метод) основывается на взаимодействии иона двухвалентной меди (Cu2+) с белком в щелочной среде и образовании цветного окрашивания раствора, оптическая плотность которого измеряется при длине волны 545 нм. Данный метод демонстрирует минимальное различие между равными количествами иммуноглобулиновых и альбуминовых проб. Добавление натрия гидроксида и биуретового реактива в качестве комбинированного реагента, незначительное смешивание после добавления натрия гидроксида или значительный период времени между добавлением натрия гидроксида и добавлением биуретового реактива дает более высокие значения для
иммуноглобулина по сравнению с альбуминовыми образцами. Метод трихлоруксусной кислоты, используемый для минимизации влияния интерферирующих веществ, также может использоваться для определения содержания белка в исследуемых образцах при концентрациях ниже 500 мкг/мл.
